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    微生物的培养与分离方法
    点击次数:146 发布时间:2020-10-28

           核心提示:大多数细菌均可以通过人工方法培养,只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。

    接种与分离方法

    根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类,采用不同的接种方法。

           1.平板划线分离培养法

    对混有多种细菌,采用划线分离和培养,使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离,得到分散的单个菌落,以获得纯种。平板划线分离法通常有两种方法:

    ①分区划线分离法:此法常用于含菌量较多的细菌的分离。先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区(占培养基总面积的¼)并作数条划线,再于2、3、4区依次划线。每划完一个区域,均将接种环烧灼灭菌1次,冷后再划下一区域,每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。一个成功分区划线的平板,培养后分别观察1区形成菌苔,2区菌落连成线,3区和4区可分离到单个菌落。

    ②连续划线分离法:此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹,然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种,直至划满琼脂平板表面。

           2.琼脂斜面接种法

    主要用于菌落的移种,以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用接种环(针)挑取单个菌落或培养物,从培养基斜面底部向上划一条直线,然后再从底部沿直线向上曲折连续划线,直至斜面近顶端处止。生化鉴定培养基斜面接种,用接种针挑取待鉴定细菌的菌落,从斜面中央垂直刺入底部,抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。

           3.穿刺接种法

    此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种,半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落,由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处,再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基,穿刺高层部分,退出接种针后直接划线接种斜面部分。

           4.液体培养基接种法

    用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落,倾斜液体培养管,在液面与管壁交界处研磨接种物(以试管直立后液体淹没接种物为准)。此接种法应避免接种环与液体过多接触,更不应在液体中混匀、搅拌,以免形成气溶胶,造成实验室污染。

           5.倾注平板法

    本法主要用于饮水、饮料、牛乳等标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标本1ml至无菌培养皿内,再将已融化并冷却至45~50℃左右的琼脂培养基15~20ml倾注入该无菌培养皿内,混匀,待凝固后置37℃培养箱 培养,长出菌落后进行菌落计数,以求出每毫升标本中所含菌数。先数6个方格(每格为1cm2)中菌落数,求出每格的平均菌落数,并算出平皿直径,然后按下列公式计数,求出每毫升标本中的细菌数。

    全平板菌落数=每方格的平均菌落数×лr2

    每ml标本中的细菌数=全平板菌落数×稀释倍数

           6.涂布接种法

    本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表面,然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布,使被接种液均匀分布于琼脂表面,然后贴上药敏纸片,或直接培养,本法经培养后细菌形成菌苔。

    细菌的培养方法

    根据不同的标本及不同的培养目的,可选用不同的培养方法。通常把细菌的培养方法分为需氧培养、二氧化碳培养、微需氧培养和厌氧培养四种。

           1.需氧培养

    是指需氧菌或兼性厌氧菌在有氧条件下的培养,将已接种好的平板、斜面、液体培养基等在空气中置35℃孵育箱内孵育18~24h,无特殊要求的细菌均可生长。少数生长缓慢的细菌需要培养3-7d甚至1个月才能生长。为使孵育箱内保持一定的湿度,可在其内放置一杯水。对培养时间较长的培养基,接种后应将试管口塞好棉塞或硅胶塞后用石蜡-凡士林封固,以防培养基干裂。

           2.二氧化碳培养

    某些细菌,在初次分离时,须在5%~10%二氧化碳环境中培养才能生长。常用的培养法如下。

    ①二氧化碳培养箱法:二氧化碳孵箱能自动调节二氧化碳的含量、温度和湿度,培养物置于孵育箱内阁,孵育一定时间后可直接观察生长结果。

    ②烛缸培养法:取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器,将接种好的培养基放入缸内,点燃蜡烛后放在缸内稍高于培养物的位置上,缸盖或缸口均涂以凡士林,加盖密闭。因缸内蜡烛燃烧氧逐渐减少,数分钟后蜡烛自行熄灭,此时容器内二氧化碳含量约占5%~10%。将缸置于35℃普通孵育箱内孵育。

    ③气袋法:选用无毒透明的塑料袋,将已接种标本的培养皿放入袋内,尽量祛除袋内空气后将开口处折叠并用弹簧夹夹紧袋口。使袋呈密闭状态,执断袋内已置的二氧化碳产气管(安瓿)产生二氧化碳,数分钟内就可达到需要的二氧化碳培养环境,置于35℃孵育箱内孵育。

    ④化学法:常用碳酸氢钠-盐酸法。按每升容积称取碳酸氢钠0.4g与浓盐酸0.35ml比例,分别置容器内,连同容器置于玻璃缸内,盖紧密封,倾斜缸位使盐酸与碳酸氢钠接触而生成二氧化碳。于35℃孵育箱内孵育。

           3.微需氧培养

    微需氧菌培养在大气中及绝对无氧环境中均不能生长,在含有5%-6% 氧气,5%-10%二氧化碳和85%氮气的气体环境中才可生长,将标本接种到培养基上,置于上述气体环境中,35℃进行培养即微需氧培养法。

           4.厌氧培养

    厌氧菌对氧敏感,培养过程中需造成低氧化还原电势的厌氧环境。厌氧培养常用的方法有:物理法、化学法、生物法。如厌氧罐培养法、气袋法、厌氧手套箱法、需氧菌共生厌氧法等。

    细菌在培养基上生长特性

           1.固体培养基标本或液体培养物划线接种到固体培养基表面后,单个细菌经分裂繁殖可形成一个肉眼可见的细菌集团,称为菌落(colony)。

    ①菌落的形态特征:大小、形状(露滴状、圆形、菜花样、不规则等)、突起或扁平、凹陷、边缘(光滑、波形、锯齿状、卷发状等)、颜色(红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等)、表面(光滑、粗糙等)、透明度(不透明、半透明、透明等)和粘度等。据细菌菌落表面特征不同,可将菌落分为3型:

    A.光滑型菌落(S型菌落):菌落表面光滑、湿润、边缘整齐,新分离的细菌大多呈光滑型菌落。

    B.粗糙型菌落(R型菌落):菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状,边缘大多不整齐。R型菌落多为S型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质形成。R型细菌抗原不完整,毒力和抗吞噬能力都比S型细菌弱。但也有少数细菌新分离的毒力株就是R型,如炭疽孢杆菌、结核分枝菌等。

    C.粘液型菌落(M型菌落):菌落粘稠、有光泽、似水珠样。多见于厚荚膜或丰富粘液层的细菌、结核杆菌等。

    ②菌落溶血特征:菌落溶血有下列3种情况。

    α溶血:又称草绿色溶血,菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环,为高铁血红蛋白所致;

    β溶血:又称完全溶血,菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环,是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致;

    γ溶血:即不溶血,菌落周围的培养基没有变化,红细胞没有溶解或缺损。

    ③色素:有些细菌产生水溶性色素,使菌落和周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色,产生的色素有水溶性或脂溶性。

    ④气味:某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味,如铜绿假单胞菌(生姜气味)、变形杆菌(巧克力烧焦的臭味)、厌氧梭菌(恶臭味)、白色假丝酵母菌(酵母味)和放线菌(泥土味)等。

           2.液体培养基细菌在液体培养基中有3种生长现象:大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈均匀混浊;少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌等则呈沉淀生长;枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长,常形成菌膜。

           3.半固体培养基

    半固体培养基主要用于细菌动力试验,有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外,在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长,穿刺线两边的培养基仍然澄清透明,为动力试验阴性。

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